miR-375及MTDH在前列腺癌细胞中的功能研究

【摘要】第一章miR-375及MTDH在前列腺癌组织的表达及临床意义目的：研究miR-375及MTDH在前列腺癌中的表达及临床意义。方法：采用实时定量PCR技术检测10例PCa及癌旁非肿瘤组织中miR-375及MTDH的表达情况,研究其与PCa病理分期、分级之间的关系。结果：实时定量PCR发现,10例PCa患者与配对的癌旁非肿瘤组织相比,miR-375在PCa中的表达下调,MTDH在PCa中的表达上调,两者表达均有显著统计学差异(p<0.01)。根据病理分期分为T1-T2和T3a组,两组的miR-375及MTDH表达均有显著统计学差异(p<0.05)；根据病理分级分为G1-G2和G3-G4组,两组miR-375表达相比无显著差异(p＞0.05),MTDH表达相比有显著差异(p<0.05)。miR-375和MTDH在前列腺癌组织中表达存在负相关,相关系数r为-0.79(p<0.01)。结论：1、PCa中miR-375的表达水平较癌旁非肿瘤组织明显下调,MTDH在PCa中的表达上调,提示miR-375及MTDH表达可能与PCa发生发展相关。2、miR-375及MTDH表达与PCa病理分期相关,其中MTDH还与PCa病理分级相关,提示miR-375及MTDH表达可能与PCa预后相关。3、miR-375和MTDH在前列腺癌组织中表达存在负相关,提示在PCa中miR-375与MTDH之间可能存在调控关系。第二章miR-375及MTDH在不同前列腺癌细胞株中的表达目的：探讨miR-375及MTDH在PC3、DU145、LNCap前列腺癌细胞株中的表达,选择miR-375表达相对较低、MTDH表达相对较高的细胞株进行下一步实验。方法：用实时定量PCR技术检测PC3、DU145、LNCap前列腺癌细胞株中miR-375及MTDH的表达情况,WesternBolt检测PC3、DU145、LNCap前列腺癌细胞株中MTDH蛋白的表达情况。结果：实时定量PCR发现,DU145和LNCap细胞株miR-375的相对表达量均显著低于PC3(p<0.01),MTDH的相对表达量均显著高于PC3(p<0.01);WesternBolt检测结果显示DU145和LNCap细胞株MTDH蛋白的相对表达量均高于PC3(p<0.01)。miR-375及MTDH的相对表达量DU145和LNCap两者相比均无显著差异(p>0.05)。在LNCap细胞株中miR-375表达相对较低、MTDH表达相对较高。结论：1、miR-375及MTDH的表达在前列腺癌不同细胞系表达并未体现出明显与前列腺癌细胞恶性程度相关。2、LNCap细胞株中miR-375表达相对较低、MTDH表达相对较高,选择LNCap细胞株进行下一步实验。第三章miR-375与MTDH的调控关系研究目的：探讨在前列腺癌中miR-375与MTDH之间是否存在调控关系。方法：采用LipofectamineTM2000转染空载体及miR-375模拟物片段于LNCap细胞株中,实时定量PCR检测LNCap细胞株中miR-375及MTDHmRNA的表达情况,WesternBolt检测LNCap细胞株中MTDH蛋白的表达情况。结果：在LNCap中,转染空载体的阴性对照(NC)组miR-375的相对表达量低于有效转染组,有显著差异(p<0.01)；NC组MTDH的相对表达量高于有效转染组,有显著差异(p<0.01)；NC组MTDH蛋白的相对表达量高于有效转染组,有显著差异(p<0.01)。结论：1、miR-375模拟物片段能有效的转染于前列腺癌细胞中,上调前列腺癌细胞中miR-375的表达。2、在前列腺癌细胞中,上调miR-375后能有效下调MTDH表达。第四章miR-375及MTDH对前列腺癌细胞株LNCap细胞生物学行为的影响目的：探讨miR-375对前列腺癌细胞株LNCap细胞增殖、凋亡及侵袭能力等生物学行为的影响。方法：1、构建miR-375模拟物片段及MTDH干预序列,并转染到LNCap细胞中。2、实时定量PCR检测LNCap细胞株中miR-375及MTDH的表达,WesternBolt检测LNCap细胞株中MTDH蛋白及PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。3、MTT法检测细胞的存活率,AV/PI双标法FCM检测细胞的凋亡情况,细胞侵袭实验观察细胞浸袭能力。4、MTT法检测顺铂毒性预实验,选择最适药物浓度。5、LNCap细胞分六组：A前列腺癌细胞培养组；B前列腺癌细胞+miR-375模拟物转染组；C前列腺癌细胞+miR-375模拟物转染组+顺铂药物；D前列腺癌细胞+顺铂药物；E前列腺癌细胞+MTDH基因干预组；F前列腺癌细胞+MTDH基因干预+顺铂药物。检测每组miR-375与MTDH的表达、细胞存活率、细胞凋亡及细胞侵袭等生物学特征。结果：1、构建miR-375模拟物片段及MTDH干预序列,并转染到LNCap细胞中,细胞的转染效率达到80%以上。2、顺铂浓度为1ug/ml时,作用24h后肿瘤细胞存活率为83%,选择此浓度作为下一步实验的作用浓度。3、B、C、D、E、F组与A组比较,细胞存活率下降,有显著差异(p<0.05),其中C、F组与A组比较,细胞存活率明显下降,有显著差异(p<0.01)；C、F组与D组比较,细胞存活率明显下降,有显著差异(p<0.01)；B、C组分别与E、F比较,细胞存活率降低,有显著差异(p<0.05)。4、与A组比较,其它各组凋亡率增高,有显著差异(p<0.01),其中C、F组与A组比较,细胞凋亡率增高明显,有显著差异(p<0.01)；C、F组与D组比较,细胞凋亡率增高明显,有显著差异(p<0.01)；B、C组分别与E、F比较,细胞凋亡率增高明显,有显著差异(p<0.05)。5、与A组比较,其它各组细胞数量下降,有显著差异(p<0.01),其中C、F组与A组比较,细胞侵袭数量下降明显,有显著差异(p<0.01)；C、F组与D组比较,细胞侵袭数量下降明显,有显著差异(p<0.01)；B、C组分别与E、F比较,细胞侵袭数量下降明显,有显著差异(p<0.05)。6、A组的MTDH、p-PI3K-p85、Akt及p-Akt表达高于E组,差异有显著性(p<0.01)。结论：1、miR-375高表达及MTDH低表达抑制了前列腺癌细胞的增殖、侵袭转移及促进凋亡。2、上调miR-375表达及下调MTDH表达均能增加前列腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性。3、MTDH通过激活P13K/AKT通路促进前列腺癌的发生发展。4、miR-375可能通过下调MTDH表达抑制前列腺癌的发生发展。
【作者】郭琼；
【导师】杨金瑞；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】前列腺癌；miR-375；MTDH；分期；分级；PC3；DU145；LNCap；转染；调控；LNCap细胞；顺铂；增殖；凋亡；侵袭能力；化疗敏感性；

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